Problématique / Besoin :
Les protéines sont le plus souvent remises en suspension dans des solutions tamponnées et/ou isotoniques aux fluide corporels. Cependant, la mesure du potentiel zêta par ELS sur de tels solvants à conductivité élevée peut entrainer un chauffage Joule excessif, provoquant à la fois une dégradation de l'échantillon et des dommages à l'électrode. Ici, nous avons utilisé l'Univette robuste et réutilisable avec le Litesizer 500 pour mesurer le potentiel zêta de la protéine modèle lysozyme dissoute dans un tampon isotonique. Grâce à la technologie brevetée cmPALS et au Mode Protéine, une fonctionnalité logicielle qui introduit de courtes pauses dans la mesure pour permettre à l'chantillon de refroidir, nous avos pu obtenir des mesures de potentiel zêta hautement reproductibles sans endommager l'électrode.
Méthode utilisée / Réponse apportée :
1. Introduction
La mesure du potentiel zêta, qui est lié à la répulsion entre les particules, est souvent nécessaire pour caractériser les suspensions de particules. Alors que de nombreux matériaux peuvent être dissous ou dispersés dans de l'eau déionisée, certaines particules doivent être dispersées dans des solvants à haute conductivité pour préserver leur structure et empêcher la dégradation. Ceci est pariculièrement courant pour les échantillons biologiques, car les protéines, les polymères biomédicaux et les cellules doivent être dissous dans des solutions tamponnées et/ou isotoniques. Le potentiel zêta est mesuré par diffusion électrophorétique de la lumière (ELS), ce qui implique l'application d'un champ électrique à l'échantillon. Un effet secondaire courant de cette technique de mesure et le soi-disant chauffage Joule, où le courant électrique traverse un conducteur (dans ce cas l'échantillon) et produit de la chaleur. Plus la conductivité de l'échantillon est élevée, plus la chaleur sera générée, ce qui peut potentiellement entrainer une dégradation de l'échantillon et des dommages à l'électrode. Le problème est particulièrement aigu pour les échantillons biologiques, qui présentent le double inconvénient de nécessiter des solvants à haute conductivité et d'être très sensibles à la dégradation par la chaleur. Pour de tels échantillons, il donc crucial que le courant électrique soit maintenu le plus bas possible et soit appliqué le moins longtemps possible. Dans le Litesizer 500 d'Anton Paar, la technologie cmPALS brevetée permet des mesures de potentiel zêta stables et sensibles à des tensions plus basses ainsi que des temps de mesure plus courts, réduisant ainsi le stress sur l'échantillon sensible. De plus, l'utilisateur peut activer une fonctionnalité logicielle appelée "Protein Mode", qui introduit de courtes pauses pendant les mesures du potentiel zêta pour permettre à l'échantillon de se refroidir. L'Univette, une cuvette réutilisable conçue pour les mesures de potentiel zêta dans une conductivité élevée ou des solvants organiques, est suffisamment robuste pour résister à de telles conditions sans endommager l'électrode. Dans le présent rapport d'application, nous démontrons les capacités combinées du Litesizer 500 et de l'Univette, en utilisant le mode protéine de Kalliope, pour mesurer le potentiel zêta du lysozyme de la protéine modèle dans des solvants à haute conductivité.
2. Configuration expérimentale
Deux solutions différentes de lysozyme de blanc d'oeuf de poule (Sigma Aldrich) ont été préparées :
Un volume d'échantillon de 900 µl a été transféré dans la cuvette en quartz, dans laquelle l'Univette a été immergée. Le temps d'équilibrage a été fixé à 2 minutes pour la première mesure et 30 secondes pour les suivantes. Trois échantillons indépendants ont été testés pour chaque solution et 4 répétitions ont été effectuées sur chaque échantillon, pour un total de 12 mesures.
La protéine fabriquée dans le logiciel Kalliope a été activée pour permettre à l'échantillon de refroidir entre les analyses, diminuant ainsi l'impact du chauffage Joule.
3. Résultats et discussion
La conductivité moyenne de l'échantillon de 0,1 mg/mL préparé dans BisTris/NaCI, qui est mesuré automatiquement à chaque mesure de potentiel zêta, était de 6 mS/cm. Le potentiel zêta moyen pour cette solution était de 12 mV. L'écart type relatif était inférieur à 5% pour 12 mesures.
La solution à 1 mg/mL préparée dans du PBS a renvoyé une valeur de potentiel zêta comparable de 9 mV. Cependant, la conductivité moyenne de cette solution était significativement plus élevée que celle préparée dans BisTris/NaCI (29,4 mS/cm contre 6 mS/cm). Malgré cette conductivité élevée, l'écart-type relatif entre les mesures était satisfaisant, avec une moyenne de 7,2. Cela était bien en deçà de la répétabilité maximale acceptable de 10% fixée par la norme ISO et suggérait que l'ELS n'entrainait pas de dégradation significative de l'échantillon. Un examen visuel des électrodes de palladium de l'Univette après les 12 mesures a également indiqué que celles-ci n'avaient subi aucun dommage visible.
4. Conclusion
Dans ce rapport d'application, nous démontrons que des mesures hautement reproductibles du potentiel zêta des protéines dans des solvants à haute conductivité sont réalisables en utilisant le Litesizer 500 avec l'Univette. La technologie brevetée cmPALS permet des mesures de potentiel zêta à des tensions plus faibles et des temps de mesure plus courts, ce qui réduit considérablement la contrainte appliquée à l'échantillon. Cela rend les mesures ELS possibles même pour les échantillons de protéines à faible concentraion(0,1 mg/ml) et à conductivité élevée. De plus, le mode protéine dédié de Kalliope, qui limite le chauffage Joule pendant l'ELS, contribue davantage à la préservation de l'échantillon et de la cuvette.
